Ensayos reporteros
Un ensayo reportero bioluminiscente consta de una enzima reportera luciferasa y de un reactivo de detección que proporciona el sustrato de la enzima. Cuando se combinan la enzima reportera y el reactivo de detección, la luz emitida, detectada utilizando un luminómetro, es proporcional a los niveles de expresión del gen reportero. Disponemos de reactivos bioluminiscentes para detectar NanoLuc®, firefly y Renilla luciferasas, con múltiples opciones de detección para cada enzima con el objetivo de crear un ensayo reportero optimizado para unos objetivos experimentales específicos. Los reactivos de detección varían en cuanto al brillo y la estabilidad de la señal, e incluyen soluciones líticas o para células vivas, además de permitir la detección de uno o dos reporteros.
La firefly luciferasa puede combinarse con la NanoLuc® Luciferase y ser detectada utilizando el Nano-Glo® Dual-Luciferase® (NanoDLR™) Reporter Assay System, o combinarse con la Renilla luciferasa y ser detectada utilizando el Dual-Luciferase® Reporter Assay System. El uso de dos reporteros genéticos constituye un ensayo reportero que incluye un control para la normalización o un segundo reportero experimental para obtener más información en cada ensayo.
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¿Qué son los ensayos reporteros?
Los ensayos reporteros permiten medir fácilmente una respuesta biológica. Existen muchos genes reporteros, como la fosfatasa alcalina, la β-galactosidasa, las proteínas fluorescentes y las luciferasas. Las luciferasas se utilizan para crear ensayos reporteros bioluminiscentes altamente cuantitativos, sensibles en un amplio rango dinámico y que se detectan de forma sencilla midiendo la producción de luz. Existen muchas clases de bioluminiscencia, todas ellas basadas en la interacción de la enzima luciferasa con un sustrato luminogénico que genera luz. Las luciferasas más utilizadas en aplicaciones de reporteros genéticos son la luciferasa del escarabajo (incluida la luciferasa firefly), la luciferasa de Renilla y la luciferasa modificada del camarón de aguas profundas (NanoLuc® Luciferase).
Para crear un ensayo reportero de luciferasa, el gen reportero de la luciferasa se introduce en una célula utilizando métodos como la transfección transitoria o estable. La luciferasa intracelular se cuantifica normalmente añadiendo una solución tampón que contiene un detergente para lisar las células y un sustrato de luciferasa para iniciar la reacción luminiscente. Pueden cuantificarse entre 10–20 moles de luciferasa o menos por muestra. Esto corresponde aproximadamente a 10 moléculas por célula, lo cual confiere a estos ensayos de un amplio rango dinámico lineal para la cuantificación. Las formas secretadas de luciferasa pueden medirse tomando muestras del medio y realizando el ensayo luciferasa en una placa aparte. Algunas luciferasas intracelulares, como las luciferasas NanoLuc® y Renilla, pueden detectarse sin necesidad de lisis celular para llevar a cabo ensayos reporteros en células vivas que midan la cinética de una respuesta celular.
En la mayoría de los ensayos reporteros genéticos intervienen uno o dos genes reporteros. A menudo, el segundo gen reportero se expresa a partir de un vector de "control" para normalizar los resultados del gen reportero experimental. Por ejemplo, el segundo gen reportero puede controlar la variación en el número de células o la eficacia de la transfección. Normalmente, el gen reportero de control está dirigido por un promotor constitutivo y el vector de control se cotransfecta con el vector "experimental". Se utilizan genes reporteros diferentes para los vectores de control y experimental, de modo que las actividades relativas de los dos productos reporteros puedan analizarse de manera individual. Consulte nuestra Reporter Assay Selection Guide para obtener más información sobre cómo seleccionar el mejor ensayo reportero para sus necesidades.
