Kinase Target Engagement
Los NanoBRET™ Target Engagement (TE) Intracellular Kinase Assays permiten medir de forma cuantitativa interacciones específicas quinasa-inhibidor en células vivas mediante transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET). El ensayo mide la afinidad celular aparente de los compuestos de ensayo unidos por desplazamiento competitivo de un trazador fluorescente NanoBRET™ permeable a la célula, unido de forma reversible a una quinasa-NanoLuc® Luciferase Fusion en células.
Ensayos NanoBRET™ Kinase Target Engagement
- Medir el Target Engagement de quinasas en células vivas: Cuantifica la afinidad del compuesto y la ocupación fraccional para múltiples tipos de inhibidores de quinasas (I-IV).
- Ensayos para más de 340 quinasas: Ensayos listos para su uso que abarcan todo el kinoma y que permiten analizar de forma fácil la selectividad.
- Uso de quinasas de longitud completa: Los ensayos utilizan quinasas wild-type de longitud completa. También están disponibles ensayos de quinasas mutantes o de quinasas de dominio específico.
- Formato de placa multipocillo: Un método de ensayo sencillo y escalable de 96 a 384 pocillos o más.
- Evaluar el tiempo de residencia: Determina la duración de la unión del compuesto de ensayo a la quinasa diana en células vivas.
Qué necesitas para realizar un ensayo NanoBRET™ TE
Los trazadores y las combinaciones de sustrato/inhibidor también están disponibles como productos independientes.
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Cómo funcionan los NanoBRET™ Kinase Target Engagement Assays
Se introduce un vector de fusión quinasa-NanoLuc® por transfección en células de mamífero para su expresión. Como luciferasa NanoLuc® es extremadamente brillante, sólo se necesita una baja expresión de la proteína de fusión quinasa-NanoLuc®.
En el NanoBRET® TE Kinase Assay se suministra un trazador fluorescente NanoBRET™ permeable a las células, un sustrato NanoLuc® y el inhibidor extracelular de NanoLuc®. La adición de éstos a las células que expresan la fusión quinasa-NanoLuc® permite obtener una señal BRET intensa entre la proteína quinasa-NanoLuc® y el trazador NanoBRET™. El inhibidor extracelular de NanoLuc® garantiza que la señal BRET obtenida procede de células vivas no dañadas.
La presencia de un compuesto de ensayo no marcado que se une a la quinasa diana provoca una pérdida de señal BRET. Dado que la tecnología BRET tiene restricciones de distancia estrictas, los datos obtenidos son específicos de la quinasa fusionada a la luciferasa NanoLuc®. Además, los datos dan como resultado una afinidad intracelular cuantitativa siempre que se utilice la concentración de trazador adecuada.
Ejemplos de datos Kinase Target Engagement
Medir la afinidad, la selectividad, la potencia y el tiempo de residencia
Obtener una medida cuantitativa de la afinidad intracelular del compuesto
Determinar la selectividad celular de los compuestos y la ocupación fraccional para quinasas relacionadas
NanoBRET™ Target Engagement puede utilizarse para comparar la afinidad del inhibidor para quinasas de tipo salvaje (WT) y mutantes. NanoBRET™ TE Intracellular Kinase Assay K-10 se utilizó para JAK y JAK(V617F), que es una mutación clínicamente adquirida que se encuentra en cánceres mieloproliferativos. Panel A: Engagement de los inhibidores competitivos de ATP tipo I contra JAK2(V617F). Panel B: La potencia de engagement de la diana fue mayor para el inhibidor de tipo I ruxolitinib con JAK2(V617F) frente a JAK2 de tipo salvaje. Panel C: Esto difirió del hallazgo encontrado con el inhibidor de tipo II CHZ-868, que tenía una afinidad similar por las quinasas JAK2(V617F) mutante y JAK2 de tipo salvaje.
Lograr una mejor correlación entre la afinidad del compuesto y la potencia funcional posterior
Los datos de NanoBRET™ Target Engagement pueden correlacionarse con la potencia funcional celular. Panel A: Las afinidades celulares del inhibidor multiquinasa Crizotinib por un panel de quinasas de longitud completa en células vivas se obtuvieron mediante ensayos NanoBRET™ TE Kinase. Se ha descubierto que las quinasas MET y ALK son las dianas principales de Crizotinib. Panel B: Estas afinidades aparentes de Crizotinib se utilizaron para crear un gráfico de correlación utilizando las potencias fosfo-ELISA celulares publicadas para estas mismas quinasas. Los resultados indican que los datos de NanoBRET™ TE pueden correlacionarse bien con datos de ensayos funcionales celulares como fosfo-ELISA. Las afinidades de los inhibidores de quinasas NanoBRET™ TE pueden predecir la inhibición observada con ensayos de potencia celular de menor rendimiento. Para más detalles del estudio, consulta Vasta et al. (2018) Cell Chem Biol. 25(2), 206-214.
Evaluar el tiempo de residencia de los compuestos en células vivas
Preguntas frecuentes
Los manuales técnicos de los NanoBRET™ TE Intracellular Kinase Assays (#TM598 y #TM603) utilizan células HEK293. Sin embargo, se han utilizado otros tipos celulares, como HeLa y U2OS. Si se utilizan tipos celulares diferentes a HEK293, se recomienda optimizar las condiciones de transfección para introducir el vector de fusión quinasa-NanoLuc®.
El nuevo formato de ensayo adherente (ADH) es más eficaz para el usuario en comparación con el formato original de superficie no adherente (NBS). El formato ADH implica el uso de células adheridas en una placa tratada para cultivo de tejidos.
El formato NBS requiere que las células se transfecten en placas o platos el día anterior a la adición a la placa de ensayo. El día del ensayo, las células se colectan y se siembran en placas de superficie no adherente antes de realizar el ensayo. Las placas de superficie no adherente son ideales para determinados trazadores con propiedades subóptimas que dificultan su uso en placas de ensayo de poliestireno convencionales.
El formato ADH utiliza placas tratadas para cultivo de tejidos y permite al usuario transfectar el vector de fusión quinasa-NanoLuc® en la placa de ensayo. Con el formato ADH no es necesario el paso de colecta y siembra, ya que las células se transfectan y siembran en la placa del ensayo el día anterior.
Todas las quinasas y complejos de quinasas disponibles se enumeran aquí con enlaces a Notas de Aplicación y datos. Si la quinasa también se ha ensayado en el formato NBS, se incluye en la tabla un enlace independiente a la Nota de Aplicación. Las Notas de Aplicación también están disponibles en las páginas de cada vector de fusión quinasa-NanoLuc®.
Para cada quinasa, hay un ensayo/trazador recomendado, que proporciona el mayor rango de ensayo. Sin embargo, varias quinasas tienen Notas de Aplicación adicionales que utilizan ensayos alternativos. En la página del vector de fusión quinasa-NanoLuc® se pueden encontrar datos adicionales más allá del ensayo recomendado.
Dependiendo de tus necesidades, tener un ensayo con el mayor rango puede ser ventajoso, por lo que el ensayo recomendado sería el que deberías seleccionar. En otros casos, puede ser preferible trabajar con el mismo ensayo/trazador para múltiples quinasas. En este caso, el ensayo recomendado puede no ser el mismo para cada quinasa estudiada. Por favor, consulta los documentos #TM598 o #TM603 para conocer las directrices sobre el rango de ensayo y las capacidades del ensayo.
Se han desarrollado otros vectores de fusión quinasa-NanoLuc® y NanoBRET™ TE Kinase Assays, que están disponibles a través de nuestro servicio de soluciones de I+D a medida (TRS). Si no se ha desarrollado un ensayo para la quinasa, el equipo de TRS podría desarrollar uno para ti o guiarte en el desarrollo de tu propio ensayo. En este capítulo de Methods in Molecular Biology también hay disponible un recurso para desarrollar ensayos NanoBRET™ TE. Informate aquí.
Publicaciones
Perfil cuantitativo de quinasas de amplio espectro en células vivas para evaluar el efecto del ATP celular en el Target Engagement
En este artículo de 2018 de Cell Chemical Biology, Vasta et al. describen un método basado en la transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) para medir el kinase target engagement dentro de células vivas.
Un ensayo celular BRET Target Engagement de alto rendimiento vincula la actividad bioquímica y celular de la tirosina quinasa de Bruton
En este artículo de 2019 SLAS Discovery, Ong et al. utilizan métodos NanoBRET™ TE para caracterizar la ocupación de dianas para BTK.
Cuantificación de la selectividad de los inhibidores CDK en células vivas
En este artículo publicado en Nature Communications en 2020, los equipos del Consorcio de Genómica Estructural y Promega utilizaron la tecnología NanoBRET™ Target Engagement para desvelar sorprendentes patrones de selectividad de CDKIs conocidos y líneas de investigación clínicas abandonadas.
¿En qué podemos ayudarte?
Además de los ensayos de quinasa prediseñados que aparecen en esta página, también ofrecemos kits y reactivos para construir tus propios ensayos NanoBRET™ Target Engagement, así como servicios para el desarrollo de ensayos personalizados.
