Interacciones proteína:ADN
Los productos de Promega para estudiar las interacciones proteína:ADN incluyen gel shift assays y el HaloCHIP™ System— una alternativa rápida a los métodos tradicionales de inmunoprecipitación de cromatina. En el método HaloCHIP™, las proteínas de unión al ADN de interés se expresan en células como proteínas de fusión HaloTag®, se entrecruzan al ADN y luego se capturan utilizando la HaloLink™ Resin, que forma una interacción covalente de alta especificidad con las proteínas HaloTag®. La resina puede lavarse de manera meticulosa para eliminar el ADN y las proteínas unidas de forma inespecífica siendo más eficaz que mediante la co-inmunoprecipitación. Los enlaces cruzados se invierten para separar los fragmentos de ADN purificados de la resina. No se requieren anticuerpos.
Los Gel Shift Assay Systems contienen oligonucleótidos diana, un extracto de control que contiene proteínas de unión al ADN, un tampón de unión y reactivos para fosforilar oligonucleótidos. El Gel Shift Assay System completo contiene cinco oligonucleótidos adicionales de doble cadena que representan sitios consenso de unión para AP1, NF-κB, OCT1, CREB y TFIID. Estos oligonucleótidos pueden marcarse en el extremo y utilizarse como sondas específicas de proteínas o como ADN competidor específico o inespecífico en ensayos competitivos.
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Fundamentos sobre las interacciones proteína:ADN
El análisis de las interacciones proteína:ADN requiere a menudo de métodos sencillos para inmovilizar las proteínas en superficies sólidas en orientaciones adecuadas sin alterar su estructura o función. Esta inmovilización no debe interferir en la capacidad de unión y puede lograrse mediante el uso de marcadores de afinidad. Los microarrays de proteínas funcionales contienen normalmente proteínas funcionales de longitud completa o dominios proteicos unidos a una superficie sólida. Se utiliza ADN marcado con fluorescencia para analizar la matriz e identificar las proteínas que se unen a la sonda específica. Los microarrays de proteínas constituyen un método de alto rendimiento de identificación de las interacciones proteína:ADN.
La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un método utilizado para determinar si las proteínas de unión al ADN, como los factores de transcripción, se asocian a una región genómica específica en células o tejidos vivos. Las células se tratan con formaldehído para formar enlaces cruzados covalentes entre las proteínas que interactúan y el ADN. Tras el entrecruzamiento, las células se lisan y los extractos celulares crudos se someten a sonicación para romper el ADN. El complejo ADN:proteína se inmunoprecipita utilizando un anticuerpo que reconozca la proteína de interés. Los complejos aislados se lavan y se eluyen.
El ensayo ChIP estándar requiere 3-4 días para completarse y requiere anticuerpos sumamente específicos frente a la proteína de interés para inmunoprecipitar el complejo ADN:proteína. Los ensayos HaloCHIP™ tardan 24-48 horas y no requieren anticuerpos, generando resultados en menos tiempo y con menos pasos que los ensayos ChIP tradicionales.
El ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) o gel shift assay es un método sencillo para detectar proteínas de unión al ADN que se utiliza ampliamente en el estudio de secuencias específicas de proteínas de unión al ADN, como los factores de transcripción. El gel shift assay se basa en la observación de la migración de los complejos de proteína y ADN a través de un gel de poliacrilamida no desnaturalizante, siendo esta más lenta que la migración de los fragmentos de ADN libres o los oligonucleótidos de doble cadena debido al aumento de masa.
Los gel shift assays se realizan incubando una proteína purificada o una mezcla compleja de proteínas con un fragmento de ADN marcado que contiene el supuesto sitio de unión a la proteína. A continuación, los productos de la reacción se analizan en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante. La especificidad de la proteína de unión al ADN para el supuesto sitio de unión se establece mediante ensayos competitivos utilizando fragmentos de ADN u oligonucleótidos que contienen un sitio de unión para la proteína de interés u otras secuencias de ADN no relacionadas.
