Interacciones entre proteínas en células vivas
Las interacciones proteína:proteína (PPI) son elementos esenciales de las redes celulares de transducción de señales. Aunque existen numerosos enfoques para monitorizar las PPI in vitro, los métodos para la detección intracelular son más limitados.
La brillante luminiscencia y el pequeño tamaño de la NanoLuc® Luciferase permiten una detección sensible de las interacciones entre proteínas in vivo mediante métodos basados en BRET (NanoBRET™) o en reporteros de complementación (NanoBiT®).
Las tecnologías NanoBRET™ y NanoBiT® que presentamos permiten la detección de interacciones entre proteínas a nivel de expresión endógena de una forma que hasta ahora no había sido posible. Las tecnologías de ensayo reversible le permiten estudiar tanto la inducción como la inhibición de las interacciones entre proteínas utilizando los métodos NanoBRET™ o NanoBiT® con un formato de ensayos en células vivas que permiten monitorizar la cinética de interacción en tiempo real. Ambas tecnologías son compatibles con métodos a pequeña escala o de alto rendimiento en placas multipocillo.
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¿Qué son las interacciones entre proteínas en células vivas?
Los métodos tradicionales para estudiar las interacciones entre proteínas, como la co-inmunoprecipitación, no proporcionan información directa del entorno celular.
Mediante la transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET), es posible medir de forma cuantitativa la interacción entre proteínas en células vivas. En algunos casos, es posible incluso medir estas interacciones en tiempo real, observando no sólo la formación de la interacción sino también la disociación de los componentes.
La técnica BRET mide las interacciones entre proteínas utilizando un donante bioluminiscente fusionado a una proteína de interés y un receptor fluorescente fusionado a la proteína de unión. El donante bioluminiscente, normalmente una luciferasa, no excita el fluoróforo mediante luz, sino que transfiere la energía de resonancia a través del acoplamiento dipolo-dipolo. Para transferir la energía de resonancia, el donante debe estar a menos de 10nm del receptor y en la orientación adecuada, lo que hace que la técnica sea útil para medir proteínas que se encuentran muy cerca. El solapamiento espectral entre el donante bioluminiscente y el aceptor fluorescente es un factor importante para conseguir una transferencia de energía óptima a la vez que se minimiza la señal de fondo, por lo que se requiere de una instrumentación adecuada para separar las señales del donante y del aceptor.
Las interacciones entre proteínas también pueden detectarse en células vivas mediante ensayos basados en la complementación, en los que se genera una enzima reportera activa cuando los componentes de las subunidades se acercan por la interacción de dos proteínas. Los ensayos basados en la complementación suelen proporcionar una medida directa de la actividad del reportero con unos requisitos de instrumentación más sencillos.
En los estudios de interacción de proteínas en células vivas, es importante asegurarse de que la tecnología utilizada no interfiere de forma significativa con la función normal de la proteína, así como garantizar que las subunidades de la enzima no se auto-asocian en ausencia de las proteínas que interactúan. El pequeño tamaño y la brillante señal de la Nanoluc® Luciferase permiten la detección a niveles de expresión nativos y bajos con una interferencia mínima con la función natural de la proteína. La baja autoafinidad de las subunidades NanoBiT® combinada con una detección en células vivas ofrece un análisis cinético en tiempo real de las dinámicas de interacción de proteínas en células vivas.
