Amplificación de STR

El genoma humano está repleto de regiones hipervariables de ADN repetitivo que consisten en una secuencia corta de ADN que se repite en tándem. Estas regiones son polimórficas en el sentido de que la secuencia varía en el número de copias de la unidad repetida. El número de unidades repetidas se indica con la denominación del alelo.

Los loci STR se amplifican utilizando cebadores PCR marcados con fluorescencia que rodean las regiones hipervariables. Uno de los puntos fuertes de la tipificación del ADN basada en la PCR es el grado de amplificación de éste. Partiendo de una sola molécula de ADN, se pueden sintetizar millones o miles de millones de moléculas de ADN tras 30 ciclos de amplificación. Este nivel de sensibilidad permite a los científicos extraer y amplificar ADN de muestras pequeñas o dañadas obteniendo perfiles de ADN útiles.

Los sistemas de amplificación de STR pueden adaptarse a un rango de concentraciones de ADN molde. La mayoría de los sistemas PowerPlex® STR de Promega proporcionan un equilibrio óptimo entre alelos y entre locus con 0,5-1,0ng de ADN molde. Sin embargo, la instrumentación de amplificación y detección puede variar. Por lo que es posible que necesite optimizar los protocolos, incluyendo el número de ciclos y las condiciones de detección (por ejemplo, el tiempo de inyección o el volumen de carga) para cada instrumento de su laboratorio. 

Tras la preparación, las reacciones se someten a ciclos térmicos y los productos de la PCR se separan por tamaño mediante electroforesis capilar (EC). Durante la electroforesis, las moléculas de ADN se mueven a través de una matriz polimérica en respuesta a un campo eléctrico. La velocidad a la que migran depende del tamaño del fragmento, por lo que los fragmentos de ADN más pequeños migran más rápido a través de la matriz porosa que los fragmentos más grandes. Los instrumentos utilizan un láser cerca del ánodo del capilar o del gel de poliacrilamida para excitar y detectar los productos fluorescentes de la PCR, que aparecerán como picos en el electroferograma generado. Cada dye se detecta en un canal de fluorescencia. Para reducir el background, se debe realizar una calibración espectral con el fin de corregir el solapamiento espectral de los dyes.

La separación por tamaño de los productos de amplificación en paralelo a la separación de un allelic ladder, que consiste en todos los alelos principales de un locus particular, permite la identificación de cada uno de los alelos que componen el perfil de ADN. Un estándar de tamaño interno se incluye en cada análisis para controlar la variación en la migración de una inyección a otra.