Vectores reporteros genéticos y líneas celulares
Ofrecemos vectores reporteros de luciferasa que contienen genes reporteros NanoLuc®, firefly y Renilla. Entre ellos disponemos de vectores sin promotor para clonar la región reguladora de interés, constructos que codifican genes reporteros de vida media corta para una respuesta más inmediata a los cambios en los niveles de transcripción, así como vectores para crear fusiones proteína-reportero. Por otro lado, disponemos de vectores de luciferasa firefly prediseñados con elementos de respuesta para investigar vías de señalización específicas, así como vectores reporteros de coincidencia en los que dos genes reporteros se expresan a partir de un transcrito. Los vectores pGL4 expresan genes reporteros firefly y Renilla y están optimizados para maximizar la expresión, minimizar las respuestas off-target y responder de forma rápida a las dinámicas transcripcionales. La serie de vectores pNL se basa en el esqueleto de pGL4 y ofrece distintas opciones para expresar el gen reportero NanoLuc®.
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Fundamentos sobre vectores reporteros genéticos
El uso más habitual de los genes reporteros es el análisis de la expresión génica y la caracterización de la función de elementos reguladores cis-acting, como promotores y potenciadores. Sin embargo, la expresión génica implica mucho más que la mera transcripción, y los genes reporteros también pueden utilizarse para estudiar otros fenómenos celulares como la regulación de los miARN. Las características de un vector reportero dependerán de la aplicación prevista y, por lo general, incluyen una forma del gen reportero, elementos upstream como un promotor o un elemento de respuesta y, a menudo, un marcador seleccionable que permite la generación de líneas celulares estables.
La popularidad de la luciferasa firefly nativa como reportero genético se debe a la sensibilidad y comodidad del ensayo enzimático y al estrecho vínculo de la síntesis de proteínas con la actividad enzimática. La luciferasa firefly, codificada por el gen luc, es un monómero que no requiere modificaciones postraduccionales; está disponible como enzima madura de forma directa tras la traducción de su ARNm. Luc2 es un gen mejorado de la luciferasa firefly que ha sido optimizado en los codones para mejorar su expresión en células de mamífero.
NanoLuc® Luciferase es una pequeña enzima monomérica (19,1 kDa, 171 aminoácidos) basada en la luciferasa del camarón de aguas profundas Oplophorus gracilirostris. Esta enzima diseñada mediante ingeniería genética utiliza un nuevo sustrato, la furimazina, para producir una luminiscencia de alta intensidad y de tipo "glow" en una reacción independiente del ATP. A diferencia de otras formas de luciferasa, la NanoLuc® Luciferase es idónea para aplicaciones con genes reporteros estándar (líticos), basados en secreción y en células vivas (no líticos). El pequeño tamaño del gen (513 pb) y de la proteína codificada es ideal para aplicaciones con virus y fusiones de proteínas.
Renilla luciferasa es una enzima monomérica de 36kDa que cataliza la oxidación de la coelenterazina produciendo coelenteramida y luz azul de 480nm. El gen hRluc ha sido modificado para eliminar la mayoría de los sitios de unión a factores de transcripción más crípticos y mejorar la expresión en mamíferos mediante la optimización de codones. Como molécula reportera, Renilla luciferasa se utiliza a menudo como control de normalización en ensayos de doble reportero junto a la luciferasa firefly, además de utilizarse como reportero de células vivas.
